4月22日，上海科技大學(xué)聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所、清華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所和重慶醫(yī)科大學(xué)等多家單位在《自然》(Nature)上共同發(fā)表了題為“Substrate recognition and cleavage mechanism of the monkeypox protease, Core protease”的最新研究成果。聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)天花病毒、猴痘病毒等正痘病毒屬的核心蛋白酶(Core Protease，CorePro)是一個(gè)全新的廣譜抗病毒藥物靶標(biāo);解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維空間結(jié)構(gòu)，揭示了其識(shí)別底物的分子機(jī)制;在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)成功設(shè)計(jì)了多個(gè)具有強(qiáng)效廣譜抗病毒活性的小分子抑制劑并闡明其精確作用機(jī)制。該系統(tǒng)性研究為廣譜抗正痘病毒(如猴痘病毒)藥物的開(kāi)發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。上?？萍即髮W(xué)為第一完成單位。

　　正痘病毒屬包含天花病毒、猴痘病毒等重要的人類(lèi)病毒，它們是一類(lèi)有包膜的雙鏈DNA病毒。天花病毒引發(fā)的天花曾經(jīng)是人類(lèi)歷史上極具毀滅性的傳染病之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，曾導(dǎo)致數(shù)億人死亡。猴痘病毒(mpox virus, MPXV)于1958年首次在實(shí)驗(yàn)猴群中被分離鑒定，1970年報(bào)道了首例人感染病例。猴痘病毒感染后的典型癥狀包括高熱、持續(xù)性頭痛、特征性淋巴結(jié)腫大以及漸進(jìn)性皮膚損傷等，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)腦炎、敗血癥、永久性視力喪失甚至死亡。2022年5月非流行區(qū)爆發(fā)疫情以來(lái)，猴痘病毒確診病例數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。世界衛(wèi)生組織(WHO)分別于2022年7月23日和2024年8月15日兩次啟動(dòng)最高級(jí)別警報(bào)，將猴痘疫情列為"國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件"(PHEIC)。截至最新統(tǒng)計(jì)，131個(gè)國(guó)家和地區(qū)累計(jì)報(bào)告超過(guò)13.4萬(wàn)例實(shí)驗(yàn)室確診病例，其中死亡291例。目前針對(duì)猴痘病毒感染的預(yù)防和治療手段非常有限。因此，發(fā)現(xiàn)和確證抗正痘病毒的新型藥物靶點(diǎn)，以及開(kāi)發(fā)強(qiáng)效抗病毒抑制劑，對(duì)當(dāng)前猴痘疫情的有效控制具有現(xiàn)實(shí)緊迫性，同時(shí)為應(yīng)對(duì)其他正痘病毒的威脅提供保障。

　　正痘病毒屬的成員都編碼一種高度保守的核心蛋白酶(在痘苗病毒和猴痘病毒中稱(chēng)為I7，在天花病毒中稱(chēng)為K7)，這種蛋白酶對(duì)于病毒成熟和感染性子代病毒的產(chǎn)生至關(guān)重要。核心蛋白酶能夠精準(zhǔn)識(shí)別Ala-Gly-Xaa序列并在甘氨酸(Gly)位點(diǎn)酰胺鍵位置進(jìn)行切割，驅(qū)動(dòng)病毒粒子從不具有感染性的未成熟病毒形態(tài)(IV)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈腥拘缘某墒觳《拘螒B(tài)(IMV)。核心蛋白酶的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致病毒失去感染能力，提示猴痘病毒核心蛋白酶是一個(gè)潛在的抗病毒藥物開(kāi)發(fā)靶標(biāo)。

　　研究團(tuán)隊(duì)成功表達(dá)并純化了具有活性的猴痘病毒核心蛋白酶，結(jié)合單顆粒冷凍電鏡和X射線晶體衍射技術(shù)，解析了其高分辨率的三維結(jié)構(gòu)(圖1)。核心蛋白酶呈現(xiàn)出二體的組裝模式，每個(gè)單體包括N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain, NTD)，催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain, CD)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)?；钚灾行奈挥诖呋Y(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)催化三聯(lián)體Cys328-His241-Asp258。猴痘病毒核心蛋白酶的二體相互作用模式與其他重要人類(lèi)病毒的蛋白酶不同，是核心蛋白酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和發(fā)揮催化功能的關(guān)鍵。

圖1 猴痘病毒核心蛋白酶的整體結(jié)構(gòu)、催化結(jié)構(gòu)域特征及二聚化模式

　　為了開(kāi)發(fā)潛在的靶向猴痘病毒核心蛋白酶的抑制劑，研究團(tuán)隊(duì)首先采用高通量篩選的方法，發(fā)現(xiàn)一種用于治療肌肉萎縮的廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑aloxistatin (E64d)對(duì)其催化活性具有較好的抑制效果，同時(shí)也表現(xiàn)出一定的抗痘苗病毒及抗猴痘病毒活性，表明aloxistatin能夠作為開(kāi)發(fā)抗痘病毒藥物的苗頭化合物。團(tuán)隊(duì)隨后解析了猴痘病毒核心蛋白酶與aloxistatin復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)aloxistatin與活性中心附近一個(gè)非催化的Cys237殘基形成共價(jià)鍵，但未能完全占據(jù)底物結(jié)合口袋，這可能是其抑制活性不強(qiáng)原因。

　　因此，為了開(kāi)發(fā)更強(qiáng)效的新型靶向抑制劑，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了病毒核心蛋白酶底物識(shí)別和催化機(jī)制的研究。研究人員以核心蛋白酶一種天然底物P25K的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一段C末端醛基取代的底物類(lèi)似物I-G18。I-G18能夠與核心蛋白酶的催化中心的Cys328共價(jià)結(jié)合，模擬催化中間態(tài)的結(jié)構(gòu)特征。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)，解析了這一復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)(圖2)。發(fā)現(xiàn)在底物的誘導(dǎo)下，核心蛋白酶活性中心發(fā)生一系列構(gòu)象變化，在S1和S2位形成特征的狹長(zhǎng)口袋，僅可容納P1位Gly和P2位Ala這兩個(gè)側(cè)鏈極短的氨基酸，解釋了核心蛋白酶對(duì)底物中這兩個(gè)位置氨基酸的高度選擇性。

圖2 猴痘病毒核心蛋白酶的底物識(shí)別機(jī)制

　　以核心蛋白酶的底物識(shí)別機(jī)制為基礎(chǔ)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了一系列擬肽類(lèi)抑制劑，其中A3-A6具有高效的病毒核心蛋白酶抑制活性(IC50范圍：44.9 nM～100.3 nM)，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗猴痘病毒活性(EC50范圍：1.98 μM～7.31 μM)和抗痘苗病毒活性(EC50范圍：1.39 μM～3.66 μM)，同時(shí)具有良好的安全性(CC50大于200 μM)。研究人員解析了抑制劑A3與核心蛋白酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)A3不僅可以與蛋白酶的催化中心的Cys328形成共價(jià)鍵，還可以利用其化學(xué)修飾基團(tuán)同底物結(jié)合口袋的氨基酸殘基形成額外的氫鍵相互作用，以增強(qiáng)其結(jié)合能力。這些研究結(jié)果表明了化合物A3-A6在后續(xù)開(kāi)發(fā)廣譜抗痘病毒抑制劑上的具有巨大潛力，是良好的先導(dǎo)化合物。

圖3 靶向抑制劑的設(shè)計(jì)策略與構(gòu)效關(guān)系(a抗猴痘病毒核心蛋白酶活性;b抗痘苗病毒復(fù)制活性;c抗猴痘病毒復(fù)制活性)

　　本研究工作是抗痘病毒藥物研究領(lǐng)域的重大突破，首次明確了核心蛋白酶的組裝模式及底物識(shí)別機(jī)制，并基于該發(fā)現(xiàn)成功設(shè)計(jì)并篩選出一系列新型擬肽類(lèi)化合物，這些化合物不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的酶活抑制效果，更展現(xiàn)出顯著的廣譜抗痘病毒活性。這些研究成果一方面為當(dāng)前猴痘病毒的防治提供了全新的科學(xué)依據(jù)和潛在治療手段，另一方面為應(yīng)對(duì)未來(lái)可能由正痘病毒屬引發(fā)的公共衛(wèi)生安全威脅儲(chǔ)備了前瞻性解決方案，具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-025-09014-x